Artigo Original 1

Abstract

Cultivo de Células de Músculo Liso: Estudo Morfológico

ResumoIntrodução: O estudo de células vivas, por tempo prolongado, pode ser realizado por meio de cultivo de células, possibilitando o estudo das particularidades das células, fora das variações sistemáticas naturais ao organismo vivo. Para tanto, cultivou-se células primárias de músculo liso da aorta de coelho. Objetivos: obtenção das células de músculo liso da aorta de coelho em cultivo primário, para estudo morfológico comparativo com as mesmas células em linhagem estabelecida. Métodos: as células em cultivo primário do músculo liso da aorta de coelho foram obtidas a partir do tecido originário, o qual foi transferido para a garrafa de cultura contendo o meio nutritivo e suplementos específicos. As garrafas contendo as células foram mantidas em incubadora a 37º C e 5% CO2. Resultados: domínio da técnica de cultivo de células primárias e linhagem estabelecida de músculo liso da aorta de coelho e a obtenção dessas células em cultura primária. A morfologia das mesmas foi comparada com a linhagem estabelecida e observou-se o aumento do volume celular e do núcleo, além da diferença na distribuição citoplasmática por microscopia confocal. Conclusões: o cultivo primário de células de músculo liso da aorta de coelho mostrou a viabilidade do método para estudo morfológico comparativo com as células musculares lisas em cultivo primário e linhagem estabelecida, sendo a primeira, a condição fisiológica mais próxima do tecido originário, visto que as células em linhagem apresentaram perda do volume celular e alteração na distribuição citoplasmática.Palavras Chaves: Músculo Liso. Células Cultivadas. Microscopia Confocal.AbstractIntroduction: In vitro techniques alow the study of live cels for prolonged periods of time, making possible the study of distinct features of cels free from systematic variations that arise in live organisms. In the present study, primary rabbit aortic smooth muscle cels were cultured. Objectives: To obtain primary cultures of rabbit aortic smooth muscle cels for a comparative morphological study with an established cel line of the same cel type. Methods: Rabbit aortic smooth muscle cels in primary culture were derived from the tissue of origin, which was transferred to a culture flask containing nutritive medium and specific supplements. The flasks containing the cels were incubated in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37° C. Results: Development of proficiency in the method for the culture of primary cels and for the established cel line of rabbit aortic smooth muscle, and in deriving these cels in primary culture. Morphological analysis by confocal microscopy revealed that the size of the nuclei and cels was larger in primary cels than in the established cel line, and differences in cytoplasmic distribution were also observed. Conclusion: The comparative morphological analysis of primary smooth muscle cels and the established cel line demonstrated the eficiency of the method for primary culture of rabbit aortic smooth muscle cels. The primary cels showed morphological characteristics more similar to those of the tissue of origin, while the cel line exhibited reduced cel size and changes in cytoplasmic distribution.Key ords: Muscle, Smooth. Cels, Cultured. Microscopy, Confocal.IntroduçãoPassado mais de cem anos desde que os primeiros experimentos de cultivo de células foram realizados por Harrison (1907)¹ e Carrel (1912)² o uso desta técnica continua sendo uma importante ferramenta de estudo. O cultivo celular é considerado como um conjunto de técnicas que mantém conservado algumas das propriedades fisiológicas, bioquímicas e genéticas preservadas em um sistema in vitro. Dependendo do grau de preservação da estrutura do tecido, do órgão de origem e da sua duração, os cultivos são classificados em diferentes tipos, tais como de órgãos, de tecido, primário e linhagem celular^3,4. O cultivo primário pode ser obtido de células recentemente isoladas de tecidos e possuem tempo limitado de vida em cultura (culturas finitas). Já as linhagens imortais, permanentes ou transformadas têm a capacidade ilimitada de crescimento em cultura. As células imortalizadas podem não possuir malignidade, porém, possuem crescimento celular contínuo com vida infinita⁴. O modelo de estudo do cultivo de células do músculo liso da aorta de coelho serve para caracterizar as diferenças morfofisiológicas dessas células (altamente especializadas, realizando inclusive contração muscular), podendo ser obtidas tanto em cultivo primário como em linhagem de células imortalizadas^5,6. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi comparar a condição mais próxima do fisiológico (cultivom primário) e a condição de linhagem imortalizada, abordando aspectos morfofisiológicos e morfométricos dessas células.MétodosCultivo de células do músculo liso da aorta de coelho (RA)A linhagem de células do músculo liso da aorta de coelho (RA) foi fornecida pelo Dr V. Buonassisi (W. Alton Jones cel science, Lake Placid, USA) cujo método de obtenção foi reportada por Buonassisi e Colburn (1983)⁷. As células foram cultivadas em meio Ham´s F12 (Nutrient Mixture F-12 Ham - Sigma Chemical Co, USA) suplementado com 10% SFB (Foetal Bovine Serum - Sigma Chemical Co, USA), 100 U/ml de penicilina e 0,1 mg/ml de estreptomicina (Sigma Chemical Co, USA), denominado meio completo, a 37°C, em atmosfera úmida contendo 5% de CO2.Obtenção de cultura primária de células de músculo liso da aorta de coelho (MLA)Para a obtenção da cultura primária de células de músculo liso da aorta de coelho (MLA), modificamos o método descrito por Buonassisi e Colburn (1983)⁷. Foram utilizadas as porções torácica e abdominal de coelhos albinos, pesando de 3-4 Kg. Após assepsia com etanol 70% foi realizada uma incisão cutânea, estendendo-se do tórax ao abdômen do animal e a artéria aorta foi removida. A aorta foi lavada 15 vezes em solução salina balanceada Hanks -HBSS (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA), e incubada em 5 ml de HBSS contendo 0,1% de colagenase tipo II (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA), 0,05 % de elastase pancreática, 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina e mantida por 30 min a 37°C, em atmosfera úmida contendo CO2. A camada adventícia foi cuidadosamente removida com o auxílio de uma pinça cirúrgica e a artéria aberta longitudinalmente para exposição da camada de células endoteliais, para a devida remoção por raspagem cuidadosa com um bisturi. A aorta foi cortada em anéis de aproximadamente 5 mm e incubada em solução de HBSS, contendo os mesmos componentes anteriormente citados, por 1 h a 37° C, em atmosfera úmida contendo 5% CO2. A inativação e a remoção dessa solução enzimática deu-se por adição de 1ml de SFB ao preparado e centrifugação dessa suspensão a 500 g por 5 minutos. O precipitado celular foi ressuspendido em 5 ml de meio completo e transferido para a garrafa de cultura de tecidos de 25 cm2, mantida em incubadora úmida a 37°C e 5% de CO2. Para a manutenção das células em cultivo renovou-se o meio completo a cada 3 dias ou de acordo com o consumo dos seus nutrientes.Imunocitoquímica para análise por microscopia de fluorescência confocalPara caracterização fenotípica das células (RA) e (MLA) quanto à presença de proteínas contráteis e regulatórias típicas do músculo liso, as células foram semeadas sobre lamínulas de vidro colocadas dentro de poços de placa de cultura de células (24 poços). Quando as células atingiram subconfluência, o meio de cultura foi aspirado, as células lavadas rapidamente com PBS (Phosphate Buffered Saline, Sigma Chemical Company, St Louis, USA) e fixadas em solução de Tyrode (NaCl 137,00 mM; KCl 2,70 mM; CaCl2.2H2O 1,36 mM; MgCl2.6H2O 0,50 mM; NaH2PO4. H2O 0,36 mM; NaHCO3 11,90 mM; Glicose 5,50 mM) contendo formaldeído 0,4%. Após a fixação, as células foram lavadas em Tyrode com glicina 1M e incubadas em solução Tyrode, contendo albumina sérica bovina BSA 1% (Sigma Chemical Company, St Louis, USA) e saponina 0,1% (Merck, Darmstadt, Alemanha). A seguir, as células foram incubadas com o corante DAPI (Molecular Probes Eugene, Oregon, USA) em solução de Tyrode com BSA 1% e saponina 0,1% para marcação do núcleo. As células foram novamente lavadas em solução de Tyrode com BSA 1% e saponina 0,1% e o mesmo procedimento foi utilizado para as marcações com os anticorpos anti alfa-miosina, anti alfa-calponina, anti alfa-caldesmon e anti alfa- tropomiosina e secundário IgG de camundongo (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Califórnia, USA) conjugado com fluoresceína FITC (Molecular Probes Eugene, Oregon, USA)⁸. Após as marcações, as células foram lavadas novamente e fez-se a montagem das lâminas e a leitura por microscópio de fluorescência Axiophot da Zeiss e Confocal de varredura a laser, Carl Zeiss modelo LSM 510, da UNIFESP-EPM, objetiva 63x 1.4 (água). Sendo possível a análise com até três laseres simultaneamente, são eles: laser de Argônio, 488 nm, Hélio/ Neônio 543 nm e o Titânio/safira 750 nm. Foram também utilizados os respectivos filtros de interferência para os fluoróforos utilizados, a fim de obterem-se os comprimentos de onda de emissão e as imagens na profundidade do plano focal. Obteve-se imagens por combinação das fatias ópticas projetadas dos eixos xy, cuja varredura linear nas células deu-se a cada 2 ms. A marcação das células com sondas fluorescentes foi feita de acordo com o método descrito por Bkaily et al.⁹.ResultadosObtenção de cultura primária de células de músculo liso da aorta de coelhoPara a obtenção da cultura primária de células de músculo liso da aorta de coelho (MLA), modificou-se o método descrito por Buonassisi e Colburn (1983)⁷, como descrito em métodos. Fez- se o cultivo primário das células de MLA, cujo fenótipo está apresentado na Figura 01 para compará-las com a resposta funcional das células RA, imortalizadas espontaneamente, cujo fenótipo está apresentado na Figura 02.

Figura 01. Micrografia de alta resolução mostrando a morfologia do citoplasma e do núcleo da célula de múculo liso da aorta de coelho (MLA) em cultivo primário (1ª passagem). As lamínulas circulares de 25 mm2 contendo as células foram montadas em câmaras circulares e mantidas banhadas com Tyrode-BSA (0,1%) a 37° C durante a visualização e aquisição das imagens. As células foram marcadas com 1µM do indicador fluorescente de Ca2+ citosólico acetoxi-metil ester (Fura-2) por 10 min. 

Figura 02. Micrografia das células de músculo liso da aorta de coelho (RA), sob microscopia de luz utilizando objetiva de 4X do microscópio NIKON TE300, aumento de 40X com 106 células/3,5 cm2. As células apresentadas estão em estado de total confluência com característica morfológica preservada.Figura 02. Micrografia das células de músculo liso da aorta de coelho (RA), sob microscopia de luz utilizando objetiva de 4X do microscópio NIKON TE300, aumento de 40X com 106 células/3,5 cm2. As células apresentadas estão em estado de total confluência com característica morfológica preservada. 
 ;Caracterização fenotípica das células de músculo liso por imunocitoquímicaPara caracterização fenotípica das células de músculo liso quanto à presença de proteínas contráteis e regulatórias típicas desse tecido, cuja descrição está em métodos, as células foram incubadas separadamente com os anticorpos e foram feitas as seguintes imunomarcações citadas abaixo, cujas colorações confirmaram a presença destas proteínas. Estes testes estão ilustrados nas Figuras 03 e 04 para anti a-miosina, Figuras 05 e 06 para anti a-calponina, Figuras 07 e 08 para anti a-caldesmon, Figuras 09 e 10 para anti a- troponina. As lamínulas contendo as células foram observadas no microscópio confocal Zeiss (LSM 510) e fez-se a tomografia óptica para a aquisição das imagens e reconstrução em 3D. 

Figura 3. Imagem de microscopia confocal das células MLA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes.
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). 
B - Anticorpo anti- a-miosina e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde). 
C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.

Figura 4. Imagem de microscopia confocal das células RA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). B - Anticorpo anti a-miosina e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde).C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.

Figura 5. Imagem de microscopia confocal das células MLA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. 
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). 
B - Anticorpo anti a-calponina e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde). 
C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.

Figura 6. Imagem de microscopia confocal das células RA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. 
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). 
B - Anticorpo anti a-calponina e secundário contra IgG

Figura 7. Imagem de microscopia confocal das células MLA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. 
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). 
B - Anticorpo anti a-caldesmon (B) e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde). 
C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.

Figura 08. Imagem de microscopia confocal das células RA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. 
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul).
B - Anticorpo anti a-caldesmon e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde). 
C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.

Figura 09. Imagem de microscopia confocal das células MLA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. 
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). 
B - Anticorpo anti tropomiosina e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde). 
C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.

Figura 10. Imagem de microscopia confocal das células RA por imunocitoquímica. A imunomarcação foi realizada por meio de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes. 
A - Núcleo celular corado com DAPI (azul). 
B - Anticorpo anti tropomiosina e secundário contra IgG camundongo-FITC (verde). 
C - Sobreposição das imagens A e B. Os parâmetros utilizados no microscópio confocal estão descritos em métodos.Caracterização morfométricas das células de músculo liso por microscopia confocalPara caracterização morfométrica das células MLA e RA quanto ao tamanho das células e do núcleo, fez-se as medidas utilizando-se ferramentas de medição do microscópio confocal. Os resultados estão apresentados na Tabela 01, que mostrou perda do volume celular e do citoplasma nas células RA comparado com as células MLA.  DiscussãoAtualmente, o uso de células em cultivo vai além do entendimento e do estudo de processos biológicos, sendo amplamente utilizada tanto nas áreas da Biologia Celular e Molecular, quanto na área da Saúde^3,4. As possibilidades do emprego de células-tronco como recurso terapêutico no tratamento de neoplasias e doenças degenerativas são promissoras. Técnicas que empregam o transplante de medula óssea utilizando células- tronco hematopoéticas obtidas do sangue de cordão umbilical, da medula óssea, ou do sangue periférico, após terapia com fatores de crescimento, já estão bem estabelecidas. Além disso, a utilização da cultura celular como etapa dos processos de terapia gênica e reposição tecidual faz desse modelo uma estratégia essencial para o tratamento de diversas doenças⁴. O conhecimento científico e tecnológico descrito nesse trabalho apresenta uma das técnicas atuais mais importantes para a observação de estruturas celulares e de tecidos, a microscopia de fluorescência confocal demonstradas nas figuras 3-109. Isso permitiu o estudo comparativo entre a condição mais próxima do fisiológico (cultivo primário) e a condição de linhagem estabelecida. A obtenção de células em cultivo primário de músculo liso da aorta de coelho mostrou a viabilidade do método para estudo morfológico comparativo entre as células MLA (Figura 01) e RA (Figura 02), sendo a primeira, a condição fisiológica mais próxima do tecido originário, que devem manter a morfologia e a fisiologia especializada deste tecido⁷. As células MLA e RA foram caracterizadas pela presença de proteínas contráteis (actina e miosina) e regulatórias (calponina, caldesmon e tropomiosina) típicas deste tecido, mostrando a especificidade dessas células, o que também descartou a presença de outros tipos celulares^5,6. As células cultivadas neste trabalho mostraram diferenças quanto ao tamanho celular e do núcleo (Tabela 01), sendo que as células MLA (Figuras 03, 05, 07 e 09) mostraram maior tamanho celular e do núcleo quando comparadas as célula RA (Figuras 04, 06, 08 e 10). As células RA apresentaram dimensões reduzidas, demonstrando perda do volume celular e nuclear com alteração na distribuição citoplasmática. Esse trabalho denota que a imortalização das células de músculo liso da aorta de coelho (RA) promoveu adaptação dessas in vitro, levando provavelmente à diminuição de síntese de proteínas, crescimento celular e armazenamento de fluidos nessas células.